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세포 사멸 및 질병 14권, 기사 번호: 319(2023) 이 기사 인용

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NOS2와 COX2 종양 발현과 ER 유방암의 불량한 임상 결과 사이에는 강한 상관관계가 확립되었습니다. 그러나 이들 효소의 종양 유도 메커니즘은 불분명하다. TCGA(Cancer Genome Atlas) 분석을 통해 NOS2와 COX2 발현 및 Th1 사이토카인 사이의 상관관계가 밝혀졌습니다. 여기서, TNBC 세포의 단일 세포 RNAseq 분석은 IL1β 또는 TNFα와 결합된 IFNγ에 의한 강력한 NOS2 및 COX2 유도를 보여줍니다. IFNγ가 세포용해성 림프구에 의해 분비되어 임상 결과를 개선한다는 점을 고려하면 IFNγ의 이러한 역할은 이분법을 나타냅니다. 이 수수께끼를 탐구하기 위해 종양 NOS2, COX2 및 CD8+ T 세포를 공격적인 ER–, TNBC 및 HER2 + 유방 종양에서 공간적으로 분석했습니다. NOS2 발현 종양 세포의 높은 발현 및 클러스터링은 간질 제한 CD8+ T 세포가 있는 종양/기질 경계면에서 발생했습니다. COX2 발현 종양 세포의 높은 발현 및 클러스터링은 CD8+ T 세포 침투가 제한되거나 부재하는 종양 중심의 면역 사막 지역으로 확장되었습니다. 더욱이, 높은 NOS2 발현 종양 세포는 위성증이 증가한 부위에 근접해 있었으며, 이는 전이 가능성이 더 높은 세포 클러스터를 암시합니다. 추가 시험관 내 실험에서는 IFNγ + IL1β/TNFα가 치료된 종양 세포의 신장 및 이동을 증가시키는 것으로 나타났습니다. 종양 미세환경에 대한 이러한 공간적 분석은 간질 제한 CD8+ T 세포가 전이 가능성이 증가할 수 있는 NOS2 발현 종양 틈새에 근접하여 존재하는 뚜렷한 주변 지역에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다.

에스트로겐 수용체 알파 음성(ER-) 및 삼중 음성 유방암(TNBC)은 유방암 유형에서 더 작은 비율을 차지하지만 덜 공격적인 ER + 종양과 비교할 때 치료 전략이 제한된 가장 공격적인 악성 종양 중 하나입니다[1]. 지난 10년 동안 상당한 비율의 암에서 NOS2 발현이 증가한 것으로 나타났습니다[2]. 흑색종에서 신경교종에 이르는 암은 NOS2를 과발현합니다[3,4,5,6]. 유방암의 경우 환자의 70% 이상에서 NOS2 증가가 보고되었습니다[7]. 흥미롭게도, 증가된 종양 NOS2 발현은 P53 돌연변이와 상관관계가 있었고 ER-(위험비 = 6)에서 불량한 생존을 예측했지만 ER + 유방암 환자에서는 그렇지 않았습니다[7, 8]. 증가된 종양 COX2 발현은 동일한 코호트의 ER 환자에서 HR 2.45로 정의된 불량한 결과를 예측하는 반면[9], 증가된 NOS2/COX2 동시 발현은 불량한 결과를 강력하게 예측했습니다(HR 21)[10]. 이러한 결과는 증가된 종양 NOS2/COX2 공동발현이 공격적인 유방암 표현형의 진행을 유도한다는 것을 시사합니다[10, 11]. 그러나 종양 내에서 NOS2/COX2 유도 메커니즘은 아직 불분명합니다.

TCGA(Cancer Genome Atlas)를 조사한 결과 종양 NOS2/COX2 발현과 인터페론 감마(IFNγ), 인터루킨-17(IL17), IL1 및 톨 유사 수용체-4(TLR4) 사이의 상관관계가 밝혀졌습니다. 항암 효과가 있습니다 [12]. 흥미롭게도 종양의 NOS2/COX2 발현 증가는 좋지 않은 임상 결과를 예측하므로 이러한 연관성은 모순적입니다[7, 9, 10]. 최근 IFNγ 및 사이토카인 또는 TLR4 작용제로 치료할 때 뚜렷한 면역 및 종양 세포에서 NOS2 및 COX2 발현이 증가한 것이 발견되었으며, 이는 이전에 보고된 피드포워드 NOS2/COX2 신호 전달과 일치합니다[10, 13]. 이러한 결과는 종양 NOS2/COX2 발현 사이의 직교 관계를 시사하며, 이는 불량한 임상 결과에 기여하는 뚜렷한 종양 미세환경을 촉진할 수 있습니다[13].

이러한 가능성을 탐구하기 위해 여기에서는 Th1 사이토카인이 시험관 내 종양 세포에서 NOS2 및 COX2 발현을 효과적으로 자극한다는 것을 보여줍니다. 단일 세포 RNAseq(scRNAseq) 분석에서는 인터루킨 1β(IL1β) 또는 종양 괴사 인자-알파(TNFα)와 결합된 IFNγ가 단일 제제로서 사이토카인보다 더 높은 NOS2/COX2 발현을 유도하는 것으로 나타났습니다. 또한, IL6 및 IL8을 포함하여 높은 NOS2 발현 ER-유방 종양[7, 10]에서 상향조절된 사이토카인은 이러한 치료에 의해 유도되었으며 NOS2/COX2 발현과 상관관계가 있었습니다. 또한, 이번 연구는 NOS2와 COX2의 발현을 향상시키는 IL1α/β 사이의 독특한 시너지 효과를 밝혀냈습니다. 다중 공간 이미징을 통해 IFNγ를 생성하는 것으로 알려진 간질 제한 CD8+ T 세포 영역에 근접한 높은 NOS2 발현 세포 클러스터가 밝혀졌으며 이러한 종양의 종양/간질 경계면에 작은 염증성 틈새가 있음을 시사합니다. COX2는 이 지역에 존재하지만 CD8+ T 세포 침투가 낮은 면역 사막 지역에서 종양 내로 더 많이 발현되었습니다. 동일한 종양 내의 개별 부위 또는 종양 사이의 지리적 영역을 비교하면 제한된 림프구 세포 영역에서 염증 부위의 공간적 및 시간적 진행이 암시되며, 이는 COX2 발현이 높은 영역의 면역 사막으로 진행됩니다. 이러한 새로운 관찰은 질병 특이적 유방암 생존율 감소와 상관관계가 있는 공격적인 종양 표현형의 뚜렷한 공간적 지문을 제공합니다[7, 10].

30–50%, >50–80%, and >80% positive cells [7]. For COX2 staining, scores of negative to weak [1, 2] or moderate to strong [3, 4] were categorized as low or high, respectively [9]. Herein, NOS2 and COX2 expressions were also analyzed by fluorescent staining performed on the Leica Biosystems (Wetzlar, Germany) Bond RX Autostainer XL ST5010 using the Bond Polymer Refine Kit (Leica Biosystems DS9800), with the omission of the Post Primary Block reagent, DAB and Hematoxylin. After antigen retrieval with EDTA (Bond Epitope Retrieval 2), sections were incubated for 30 min with COX2 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, no. 12282, 1:100), followed by the Polymer reagent and OPAL Fluorophore 520 (AKOYA, Marlborough, MA). The COX2 antibody complex was stripped by heating with Bond Epitope Retrieval 2. Sections were then incubated for 30 min with NOS2 antibody (Abcam no. ab15323, 1:50), followed by the Polymer reagent and OPAL Fluorophore 690. The NOS2 antibody complex was stripped by heating with Bond Epitope Retrieval 2 and then stained with CD8 (Abcam no. 101500, 1:100) or IFNγ (Abcam no. 231036, 1:200), followed by the Polymer reagent and OPAL Fluorophore 570. Sections were stained with DAPI and coverslipped with Prolong Gold Anti-Fade Reagent (Invitrogen). Images were captured using the Aperio ScanScope FL whole slide scanner (Leica). The original IHC previously reported [7, 9] and fluorescent NOS2/COX2 staining results were generally consistent./p>